通过全基因组或靶向sgRNA文库的慢病毒感染，在细胞群体水平系统性扰动基因功能，结合高通量测序定量各sgRNA的富集/耗尽，配合单细胞测序解析筛选结果，是发现药物靶点、耐药机制和必需基因的强大工具。
全基因组或通路 CRISPR 筛选的实验逻辑是“病毒文库整合→多孔或重复筛选→gDNA 抽提→建库测序→读数归一与显著性分析”。低 MOI 使大多数细胞只携带一个 sgRNA，表型可追溯到基因。CRISPRa/CRISPRi 以 dCas9 融合转录调节域，在切割缺失下改变表达水平。Perturb-seq 将单细胞转录与条形码 sgRNA 结合，在异质性细胞群中解析网络响应。
在靶点与通路发现中的位置
与化学筛选互补，扰动组库在机制不明表型、合成致死、耐药等问题的探索中具有独特优势，但须注意批次效应、Off-target 与功能冗余。
三种主要CRISPR文库覆盖基因功能扰动的不同模式，满足多样化研究需求。
sgRNA引导Cas9在靶基因编码区产生DSB，NHEJ修复引入frameshift突变，实现基因功能性敲除。全基因组KO文库可无偏好地在基因组尺度鉴定与特定表型相关的必需基因。
dCas9融合转录激活域（VP64、VPR或SAM复合体）靶向基因启动子区，上调内源基因表达，用于增益功能（gain-of-function）筛选，发现抑癌基因候选、耐药因子等。
dCas9融合转录抑制域（KRAB）靶向基因TSS上游区域，通过招募异染色质蛋白抑制转录，实现可逆的基因表达下调，适合分析剂量效应及转录调控元件。
Perturb-seq将CRISPR扰动与单细胞RNA测序结合，在单细胞分辨率同时读取基因敲除/激活状态和转录组谱，无需预先定义表型，直接从转录组变化推断基因功能。
sgRNA文库克隆至慢病毒骨架
低MOI（≤0.3）包装，确保单整合
嘌呤霉素筛选，维持≥500× coverage
生长/药物/FACS等选择压力
PCR扩增sgRNA区域
Illumina测序计数各sgRNA
RRA算法鉴定显著命中基因
| 文库名称 | 物种 | sgRNA数 | sgRNA/基因 | 特点 |
|---|---|---|---|---|
| Brunello KO | 人 | 77,441 | 4 | 高特异性设计，低脱靶 |
| Brie KO | 小鼠 | 78,637 | 4 | 对应Brunello小鼠版本 |
| GeCKOv2 KO | 人/鼠 | ~123,000 | 6 | 涵盖miRNA，历史积累丰富 |
| Calabrese CRISPRa | 人 | ~56,000 | ~2–4 | SAM激活系统配套 |
| Dolcetto CRISPRi | 人 | ~57,000 | ~3 | dCas9-KRAB配套设计 |
| 定制靶向文库 | 任意 | 定制 | 5–10 | 聚焦特定通路/基因集 |
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