06 · 蛋白与技术服务

蛋白表达与技术服务

提供原核、哺乳动物细胞及酵母多系统重组蛋白表达纯化,minicircle plasmid质粒制备,支持CGT产品早期研发与基础科研。

E. coli表达HEK293/CHOPichia酵母 Minicircle质粒

技术背景与基本原理

重组蛋白生产依赖宿主的折叠、修饰与分泌能力:大肠杆菌速度快、成本可控但糖基化与二硫键复杂域受限;CHO/HEK 体系具备哺乳动物糖型与翻译后修饰,适合治疗性蛋白;毕赤等酵母则在高分泌甲醇诱导场景中有大量工艺积累。质粒的纯度、超螺旋与内毒素对细胞转染与动物实验有直接影响。minicircle 等去除细菌骨架的环状形式可减少 CpG 相关免疫刺激并缩小分子量。

与 CGT 研发的关系

病毒包装、RNP 组分和工具酶供应常依赖可放大、可定量的蛋白与质粒工艺。

服务项目

从基础科研用重组蛋白到IND申报所需质粒原材料,提供多层次技术服务。

原核表达

E. coli 重组蛋白表达纯化

大肠杆菌是最成熟的重组蛋白表达系统,成本低、周期短、产量高,适合不需要翻译后修饰的蛋白。通过密码子优化、融合标签筛选(His、GST、MBP、SUMO)和包涵体复性优化提高可溶性表达产率。

  • 常用菌株:BL21(DE3)、Rosetta、Arctic Express(低温折叠)
  • 纯化:Ni-NTA亲和层析 → 离子交换或分子筛精纯化
  • 质检:SDS-PAGE、Western blot、SEC-HPLC纯度鉴定
  • 典型产量:数mg至数百mg/L培养物
哺乳动物表达

HEK293 / CHO 细胞表达

哺乳动物细胞表达系统可提供正确的翻译后修饰(糖基化、二硫键等),适合需要天然构象和活性的治疗性蛋白、抗体及复杂受体蛋白。

  • HEK293T/Expi293:瞬时高效表达,周期短(7–14天)
  • CHO稳转株:适合长期稳定生产,可扩大规模
  • 纯化:Protein A/G亲和(抗体);His/FLAG亲和(重组蛋白)
  • 质检:糖基化分析、SEC-HPLC、SPR/BLI活性测定
酵母表达

Pichia / Saccharomyces 表达

毕赤酵母(P. pastoris)分泌表达系统可达极高产量,适合分泌蛋白和胞外域蛋白;具备真核翻译后修饰能力,成本显著低于哺乳动物细胞系统。

  • AOX1甲醇诱导启动子,产量可达g/L级别
  • 分泌信号肽优化(α-Factor前导肽等)
  • 适合酶制剂、工业蛋白和部分治疗蛋白研究
  • Cereghino & Cregg, FEMS Microbiol Rev 2000
Minicircle质粒

Minicircle Plasmid 制备

Minicircle DNA是去除了细菌骨架(原核序列)的微型共价闭合环状DNA,仅保留目的表达盒。与传统质粒相比,可显著降低免疫原性、提高体内转基因表达效率和持续时间。

  • Kay MA, et al. Nature Biotechnology 2010
  • 生产:ParA位点特异性重组酶系统,在大肠杆菌中完成重组纯化
  • 质检:超螺旋比例(agarose gel)、内毒素(<5 EU/mg)、无菌检测
  • 适用:非病毒基因治疗、CAR-T睡美人转座子递送

蛋白表达系统比较

系统翻译后修饰表达量周期适用蛋白类型
E. coli无(糖基化)高(可达g/L)1–2周小蛋白、酶、抗原片段
HEK293T(瞬时)哺乳动物型糖基化中(mg/L)1–2周分泌蛋白、抗体、受体胞外域
CHO(稳定株)哺乳动物型糖基化高(可达g/L)2–3月(建株)治疗性抗体、融合蛋白
Pichia(分泌)高甘露糖型糖基化高(可达g/L)2–4周工业酶、部分治疗蛋白
昆虫细胞(Sf9)部分糖基化中高3–4周复杂多亚基蛋白、VLP

参考文献

内容依据公开论文,不构成对具体服务结果的承诺。

Kay MA, et al. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nat Biotechnol. 2010;28:1287–1289意义与启发:给出可规模化的 minicircle 生产菌株与纯化概念,是基因治疗用环状非病毒载体的重要工艺参考。
Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev. 2000;24(1):45–66意义与启发:为甲醇利用途径与工业放大提供统一叙述,是酵母分泌表达设计的基础文献。

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