03 · 微生物工程

微生物基因组工程

覆盖大肠杆菌、酿酒酵母、丝状真菌、噬菌体及微藻等多物种的精准基因组编辑服务，支持工程化菌株构建、代谢通路优化、蛋白异源表达及噬菌体展示文库，适用于合成生物学、工业生物技术与生物医药研究。

大肠杆菌 酿酒酵母 枯草芽孢杆菌 毕赤酵母 M13噬菌体 微藻 CRISPR/λ-Red PACE

技术背景与基本原理

大肠杆菌遗传操作历史上依赖 λ-Red 介导的短臂同源重组与噬菌体来源的重组酶系统；Datsenko–Wanner 法将卡那霉素筛选与线性 DNA 电转化结合，使基因敲除成为常规工作流。2013 年后，II 型 CRISPR 被引入多种细菌，用作可编程切口或反筛压力以提升同源供体重组效率。酵母中 HDR 本底较高，是合成生物学与蛋白表达的常用底盘；转座子随机插入与 Tn-seq 则用于全基因组适应度与必需基因研究。

工程意义

代谢通路的模块化表达、多基因同步编辑与转座子文库，共同支撑从代谢物生产到环境微生物研究的多元需求；噬菌体展示与 PACE 则与蛋白质进化衔接。

服务项目

针对多种微生物宿主提供定制化基因组工程改造服务。

细菌基因组工程

利用λ-Red同源重组系统（Datsenko-Wanner法）、CRISPR/Cas9/Cas12a辅助编辑及转座子插入等策略，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌等细菌进行精确基因敲除、敲入与通路改造。

  • λ-Red：Datsenko & Wanner, PNAS 2000
  • E. coli CRISPR：Jiang et al., Nature Biotechnology 2013
  • 支持多基因同时敲除（MAGE技术平台）
  • 工业发酵菌株代谢优化改造

真菌基因组工程

酿酒酵母（S. cerevisiae）和毕赤酵母（P. pastoris）等真核微生物遗传操作，包括基因敲除、整合表达、启动子替换及信号肽优化，适用于重组蛋白表达、代谢工程和异源基因簇重建。

  • 酵母CRISPR：DiCarlo et al., Nucleic Acids Research 2013
  • 酵母同源重组效率高，可无痕编辑
  • 毕赤酵母甲醇诱导表达系统（AOX1启动子）
  • 支持多位点同步编辑（CRISPR-assisted）

噬菌体工程 & 展示文库

M13丝状噬菌体展示技术是体外筛选特异性肽段、抗体片段（scFv/Fab）及酶的经典平台。此外提供PACE（噬菌体辅助持续进化）相关方向的实验设计与实施支持。

  • 噬菌体展示：Smith, Science 1985；Barbas et al., PNAS 1991
  • M13 pIII/pVIII噬菌体展示文库（10⁹多样性）
  • PACE平台：Esvelt et al., Nature 2011
  • 噬菌体基因组定点改造（T4、T7、Lambda噬菌体）

藻类基因组工程

莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和微拟球藻（Nannochloropsis）等模式光合微藻是研究光合作用机制、生产生物活性物质及开发生物燃料的理想模型。

  • Cas9/Cpf1 CRISPR编辑衣藻：Jiang et al., Plant Cell 2014
  • 电穿孔、玻璃珠搅打法等多种转化方式
  • 叶绿体/核基因组定向改造
  • 高值类胡萝卜素、虾青素合成途径优化

常用基因组工程技术比较

技术宿主范围编辑精度特点
λ-Red重组系统大肠杆菌及近缘单碱基–大片段无痕编辑、高效、操作成熟
CRISPR/Cas9多数细菌、酵母、真菌、藻类单碱基–大片段灵活、多位点同步、需PAM
MAGE大肠杆菌（主）寡核苷酸级高通量迭代进化，适合全局优化
转座子插入广泛随机插入饱和突变文库，基因功能筛选
PACEE. coli + M13连续定向进化快速积累突变，无需人工干预

参考文献

内容依据公开论文，不构成对具体服务结果的承诺。

Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS. 2000;97(12):6640–6645。意义与启发：建立线性 PCR 产物介导的染色体基因删除流程，是原核基因组工程的里程碑方法。
Jiang W, et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol. 2013;31:233–239。意义与启发：在细菌中联用 Cas9 切割与供体，实现高效定向编辑与反选，为 CRISPR 在原核中应用提供范式。
Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev. 2000;24(1):45–66。意义与启发：系统阐述甲醇营养型酵母的表达调控与培养策略，是毕赤表达系统工业化的经典综述。
Esvelt KM, et al. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 2011;472:499–503。意义与启发：提出 PACE 连续进化思想，为酶与结合蛋白的体外快速定向进化提供与噬菌体生命周期耦合的实验架构。
DiCarlo JE, et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 2013;41(7):4336–4343.

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